BITO prov v.13, NA22 år2 SANG.,GEL., RESTR., RFLP

Vad betyder det att man sekvenserar DNA eller RNA? tar reda på ordningsföljden av kvävebaserna i en specifik gen eller ett helt genom

När började man sekvensera virusgenom? 1970-tal

När lyckades man sekvensera hela genomet hos bakterier? Vilka bakterier? mitten av 1990-talet, E.coli och H.influenzae

Vad är shortgun sequencing? vidareutveckling av Sangersekvensering

Vad är möjligt med shortgun sequencing? sekvensera på mycket kort tid

Vad kallades projektet där man sekvenserade människans genom? När började/slutade det? HUGO-projektet, 1990-2003

Det finns många sekvenseringsmetoder och de flesta bygger på en specifik metod. Vilken? Sangers dideoxymetod

Frederick Sanger (1918-2013) fick Nobelpriset i kemi 2 gånger. När? Varför? 1958 för sitt arbete med att analysera proteinstrukturer ex. insulin, 1980 för sin metod för sekvensering

Hur lång tid tar det att sekvensbestämma DNA-strängar flera tusen baspar långa, med Sangers dideoxymetod? några timmar

Vilken metod för sekvensering används vanligtvis idag? en vidareutvecklad och automatiserad dideoxymetod

Vad behövs vid automatiserad sekvensering? DNA-polymeras, primers för DNA-polymeras att fästa vid, vanliga nukleotider, dideoxinukleosidtrifosfater

Vad är dideoxinukleosidtrifosfater? Vad gör de speciella? modifierade nukleotider, OH^- -gruppen är ersatt av en väteatom vilket gör att nästa nukleotid inte kan fästas vid den, inmärkta med ett flourescerande färgämne med specifik färg för respektive nukleotid

Förkortning för dideoxinukleosidtrifosfater: ddNTP

Förkorting för dideoxinukleosidtrifosfat för respektive nukleotid? A, T, G, C ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP

Hur genomförs automatiserad sekvensering? DNA-molekyl i enkelsträngad form tillsätts till fyra reaktionsrör med olika reaktionsblandningar innehållande en av de 4 nukleotiderna + en mindre mängd av den motsvarande modifierade nukleotiden, en ny DNA-kedja komplementär till den tillsatta byggs upp, DNA-kedjan slutar när en ddNTP binds till den, DNA-fragmenten längdsorteras genom kapillärgelelektrofores, kapillärgelen bestrålas med laser så de flourescerande färgämnena exciteras, färgsignalerna detekteras av en dator och omvandlas till DNA-sekvenser genom att jämföra fragmentens längd med nukleotiden den slutar med

Vad gäller för DNA-fragmenten som bildas vid sekvensering? startar med en primer, slutar med en modifierad nukleotid med specifik färg, längden motsvarar kvävebasens position i molekylen

Vad skiljer kapillärgelelektrofores från vanlig gelelektrofores? sker i mycket tunna kapillärer, vilket gör att man kan genomföra flera hundra samtidigt

Vad utnyttjas vid gelelektrofores? DNA-molekylens negativa laddning

Hur genomförs gelelektrofores? gjuter en platta av en massa med långa molekyler med brunnar att pipettera ner i, elektrisk spänning tvingar DNA att vandra genom detta mot plus, ju kortare DNA-sekvenser desto snabbare

Vad händer om ett prov som genomgår gelelektrofores innehåller många DNA-sekvenser av samma längd? sekvenserna lägger sig som ett band i gelen parallellt med brunnen

Vad ska man göra om man vill se banden i gelen under och efter gelelektroforesen? tillsätta färgämne som vandrar med DNA om man vill veta hur länge spänningen ska vara igång, färga gelen med ett ämne som fäster på DNA för att se tydliga band i gelen efter elektrofores

Hur kan man ta reda på /uppskatta en DNA-molekyls storlek med hjälp av gelelektrofores? genom att genomföra gelelektrofores på ett DNA med känd längd samtidigt precis bredvid och jämföra sträckan molekylerna vandrat

Restriktionsenzymer började användas inom gentekniken efter en upptäckt på 1950-talet? Vadå? vissa bakterier har enzymer som försvarar mot invaderande bakterieofager genom att klippa sönder det virala DNA:t

Hur förhindrar bakterier och arkéer att deras eget DNA klipps sönder av enzymerna som försvarar mot 'invasion'? ett annat enzym adderar metylgrupper på DNA-molekylen, vilket hindrar restriktionsenzymet från att verka

Hur vet restriktionsenzymen var på DNA-molekylen den ska klippa? känner igen en specifik kvävebassekvens i form av ett palindrom

Vad är ett palindrom? ett ord/mening/tal som blir detsamma oavsett vilket håll det läses ifrån

Vad är ett palindrom i en DNA-molekyl? kvävebassekvensen blir densamma på båda strängarna, så länge den avläses i 5'-3'-riktning

Vad kallas ändarna, när ett restriktionsenzym klipper DNA:t rakt av/parallellt? trubbiga ändar

Vad kallas ändarna, när ett restriktionsenzym klipper DNA:ets två strängar på olika ställen/förskjutet? klistriga ändar

Om man ska föra in dubbelsträngade DNA-fragment i en DNA-molekyl, är det lättast med trubbiga eller klistriga ändar? Varför? klistriga, de enkelsträngade utskjutande delarna på respektive molekyl kan bindas ihop med vätebindningar (komplementär basparning)

Om man ska föra in dubbelsträngade DNA-fragment i en DNA-molekyl, vad krävs? DNA-segmentet är utklippt med samma restriktionsenzym som DNA-molekylen klippts upp med

Vad används för att se till att orginal-DNA:et och det införda DNA:et inte bara sätts ihop med vätebindningar, utan även kovalenta bindingar mellan nukleotiderna? DNA-ligaser

Vilka viktiga funktioner har DNA-ligaser naturligt? limma ihop Okazakifragmenten vid replikation, reparera skadat DNA

Kan DNA-ligaser ligera fragment med klistriga ändar? ja

Kan DNA-ligaser ligera fragment med trubbiga ändar? vissa

Vad kallas tekniken för Southern blotting, om den används på RNA? Northern blotting

Hur genomförs Southern blotting? efter gelelektrofores påverkas DNA-strängarna med något (ofta alkalisk lösning) för att bli enkelsträngade, enkla DNA:et överförs till ett filter där samma bandmönster som på gelen bildas, tillsätter en lösning med enkelsträngat DNA komplementärt till den sekvens man söker, de bildar en dubbelsträngad hybrid märkt med ett radioaktivt eller fluorescerande ämne, platsen hittas med fotografisk film eller att man detekterar fluorescensen

Varför genomförs Southern blotting? fastställa molekylvikten och mängden/förekomsten av en viss DNA-sekvens

Vad används RFLP till? DNA-analys på STR

Vad krävs för RFLP-metoden? mycket DNA, restriktionsenzymer, agarosgel

Vad är 'filtret' man använder vid Southern blotting? ett nitrocellulosamembran

RFLP + gelelektrofores + Southern blotting var de tekniker man från början använde vid DNA-analyser. Vilken metod är vanligare idag? PCR

Vad krävs för att köra Sangersekvensering genom PCR? buffert, templat, primer, polymeras, mix av dNTP's och ddNTP's

Vilket förhållande har dNTP och ddNTP i blandningen som används vid Sangersekvensering? ca 100 dNTP:1 ddNTP

Vad kallas den sekvens en dator bildar av fluorescenssignalerna efter Sangersekvensering? elektroferogram

När publicerade Sanger sin sekvenseringsmetod? Hur länge har den använts? 1977, ledande metod i drygt 35 år, ersattes av modernare alternativ på 2010-talet men används fortfarande till mindre projekt samt verifiering av resultat från andra metoder

Vad kallas den plats där restriktionsenzymer klipper DNA? restriktionssit (restriction site)

Hur 'ser' restriktionssiterna ut? oftast 4-6 baspar långa palindrom

Vad står RFLP för? restriction fragment length polymorphism

Ex. på vad RFLP kan användas till? faderskapstest, släktskapsundersökningar, antropologiska undersökningar (folkvandning), identifiera sjukdomsalstrande organismer, kriminalteknik, livsmedelsanalys

Klicka

Skriv

Lyssna

Spel

Skriv ut